组织培养的具体方法是什么

一、培养基配制
　　配制培养基有两种方法可以选择，一是购买培养基中所有化学药品，按照需要自己配制；二是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂，如MS、B5等。

　　自己配制可以节约费用，但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题，给实验带来麻烦。就目前国内的情况看，大部分还是自己配制。为了方便起见，现以MS培养基为例介绍配置培养基的主要过程。

　　1．配制几种母液

　　1．配制MS大量元素母液

　　一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。

　　分别称取

　　NH4NO3 165g KH2PO4 17g

　　KNO3 190g CaCl2·2H2O 44g

　　MgSO4·7H2O 37g

　　各自配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

　　2．配制MS微量元素母液

　　一般将微量元素配制成100倍母液。

　　依次称取

　　KI 0.083g Na2MoO4·2H2O 0.025g

　　H3BO3 0.62g CuSO4·5H2O 0.0025g

　　MnSO4·H2O 1.69g CoCl2·6H2O 0.0025g

　　ZnSO4·7H2O 0.86g

　　配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

　　CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。

　　分别称取

　　CuSO4·5H2O 0.05g CoCl2·6H2O 0.05g

　　各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。

　　3．配制MS有机母液

　　一般配制成100倍MS有机母液。

　　依次称取

　　肌醇 10g 盐酸硫胺素（VB1） 0.01g

　　烟酸 0.05g 甘氨酸 0.2g

　　盐酸吡哆醇（VB6） 0.05g

　　配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

　　4．配制MS铁盐母液

　　一般配制成100倍MS铁盐母液。

　　依次称取

　　EDTA二钠3.73g FeSO4·7H2O2.78g

　　配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

　　所以MS母液有5种大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液，共8种母液。

　　激素母液的配制

　　各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。一般取100mg配成100ml母液。

　　2．配制培养基

　　以配置1L MS培养基为例，按顺序进行如下操作：

　　1．先在烧杯中放入一些蒸馏水。

　　2．分别取上面八种母液10ml倒入。

　　3．一般称取30g蔗糖倒入，搅拌溶解。

　　4．加蒸馏水用量筒定溶至1L。

　　5．按设计好的方案添加各种激素，由于激素的用量很小，而且激素对组培植物的生长至关重要。所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取，减少误差。

　　6．用精密试纸或酸度计调整PH至5.7-5.8。（有条件的话使用酸度计，比较精确） 可配1当量的HCL和1当量的NaOH用来调溶液PH值。

　　1当量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。

　　1当量NaOH配制：称取NaOH 4g 配成100ml溶液。

　　7．称取5g左右琼脂粉（质量好的琼脂粉),倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化。

　　8．稍微冷却后，分装入培养容器中。无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮筋或绳子扎紧。

　　9．放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右。

　　10．灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。

二、灭菌
　　灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。依此观点，无菌室等未处理的地方、超净台的表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。

　　这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点是：极小，肉眼看不见。无处不在，无时不有，无孔不入。在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。

　　无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理或化学的灭菌方法处理后的物体（当然这些方法必须已经证明是有效的），高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部都是无菌的。从以上可以看出：在地球表面无菌世界要比有菌世界小的多。

　　灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物，所以通过严格灭菌的操作空间（接种、超净台等）和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，就叫做无菌操作。

　　植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的，甚至超过微生物的培养要求，这是因为培养基含有丰富的营养，稍不小心就引起杂菌污染。要达到彻底灭菌的目的，必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌，才能保证培养时不受杂菌的影响，使试管苗能正常生长。

　　常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏水、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。

　　1．培养基用湿热灭菌

　　培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

　　注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。

　　关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1-0.15MPa，20分钟。

　　按容器大小不同，保压时间有所不同，见表。该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字，如果容器体积较大，但是放置的数量很少，也可以减少时间。