植物组织培养的步骤有哪些

组织培养的方法和步骤要根据培养目的适当选取材料，选择原则：易于诱导、带菌少。要选取植物组织内部无菌的材料。这一方面要从健壮的植株上取材料，不要取有伤口的或有病虫的材料。另一方面要在晴天，最好是中午或下午取材料，决不要在雨天、阴天或露水未干时取材料。因为健壮的植株和晴天光合呼吸旺盛的组织，有自身消毒作用，这种组织一般是无菌的。培养材料的消毒 从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带人培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上。第一步，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放人为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表面活性物质―吐温。第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸10～30s。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取1―2种使用见表。第四步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3-l0次左右。无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用注意：①酒精渗透性强，幼嫩材料易在酒精中失绿，所以浸泡时间要短，防止酒精杀死植物细胞。②老熟材料，特别是种子等可以在酒精中浸泡时间长一些，如种子可以浸泡5分钟。③升汞的渗透力弱，一般浸泡10分钟左右，对植物材料的杀伤力不大。④漂白粉容易导致植物材料失绿，所以对于幼嫩材料要慎用。⑤在消毒液中加入浓度为0.08―0.12%的吐温20或80（一种湿润剂），可以降低植物材料表面的张力，达到更好的消毒效果。灭菌剂 使用浓度(%) 持续时间（min） 去除的难易 效果次氯酸钙 9~10 5~30 易 很好次氯酸钠 2 5~30 易 很好氯化汞 0.1~1 5~8 较难 最好抗菌素 4~50mg/L 30~60 中 较好制备外植体 将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。在操作中严禁用手触动材料。接种和培养 （一）接种在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种1－2个，以防止交叉污染。（二）封口接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。 （三）温度培养基大多应保持在25℃左右，但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。 增殖外植体的增殖是组培的关键阶段，在新梢等形成后为了扩大繁殖系数，需要继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率的提高。增殖1个月左右后，可视情况进行再增殖。根的诱导继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，必须转到生根培养基上进行生根培养。1个月后即可获得键壮根系。组培苗的炼苗移栽 试管苗从无菌到光、温、湿稳定的环境进入自然环境，必须进行炼苗。一般移植前，先将培养容器打开，于室内自然光照下放3天，然后取出小苗，用自来水把根系上的营养基冲洗干净，再栽入已准备好的基质中，基质使用前最好消毒。移栽前要适当遮荫，加强水分管理，保持较高的空气湿度（相对湿度98％左右），但基质不宜过湿，以防烂苗。 植物组织培养方法 1 MS培养基的配制包括以下步骤.培养基母液的配制和保存 MS培养基含有近30种营养成分,为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量,可将培养基中的各种成分,按原量的20倍或200倍分别称量,配成浓缩液,这种浓缩液叫做培养基母液.这样每次使用时,取其总量的1/20（50 mL）或1/200（5 mL）,加水稀释,制成培养液.现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出,供配制时使用.大量元素(母液Ⅰ) mg／L NH4NO3 33 000 KNO3 38 000 CaCl2・2H2O 8 800 MgSO4・7H2O 7 400 KH2PO4 3 400 微量元素(母液Ⅱ) KI 166 H3BO3 1 240 MnSO4・4H2O 4 460 ZnSO4・7H2O 1 720 Na2MoO4・2H2O 50 CuSO4・5H2O 5 CoCl2・6H2O 5 铁盐(母液Ⅲ) FeSO4・7H2O 5 560 Na2-EDTA・2H2O 7 460 有机成分(母液Ⅳ) ⅣA 肌醇 20 000 ⅣB 烟酸 100 盐酸吡哆醇(维生素B6) 100 盐酸硫胺素(维生素B1) 100 甘氨酸 400 以上各种营养成分的用量,除了母液Ⅰ为20倍浓缩液外,其余的均为200倍浓缩液.上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液.其中,母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后,分别用少量的蒸馏水彻底溶解,然后再将它们混溶,最后定容到1 L.母液Ⅲ的配制方法是：将称好的FeSO4・7H2O和Na2-EDTA・2H2O分别放到450 mL蒸馏水中,边加热边不断搅拌使它们溶解,然后将两种溶液混合,并将pH调至5.5,最后定容到1 L,保存在棕色玻璃瓶中.各种母液配完后,分别用玻璃瓶贮存,并且贴上标签,注明母液号、配制倍数、日期等,保存在冰箱的冷藏室中.MS培养基中还需要加入2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、萘乙酸（NAA）、6-苄基嘌呤（6BA）等植物生长调节物质,并且分别配成母液（0.1 mg/mL）.其配制方法是：分别称取这3种物质各10 mg,将2,4-D和NAA用少量（1 mL）无水乙醇预溶,将6BA用少量（1 mL）的物质的量浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液溶解,溶解过程需要水浴加热,最后分别定容至100 mL,即得质量浓度为0.1 mg/mL的母液.配制培养液 用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液Ⅰ为50 mL,母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5 mL.再取2,4-D 5 mL、NAA 1 mL,与各种母液一起放入烧杯中.配制培养液时应注意：①在使用提前配制的母液时,应在量取各种母液之前,轻轻摇动盛放母液的瓶子,如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染,应立即淘汰这种母液,重新进行配制；②用量筒或移液管量取培养基母液之前,必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；③量取母液时,最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上,量取1种,划掉1种,以免出错.溶化琼脂 用粗天平分别称取琼脂9 g、蒸糖30 g,放入1 000 mL的搪瓷量杯中,再加入蒸馏水750 mL,用电炉加热,边加热边用玻璃棒搅拌,直到液体呈半透明状.然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中,最后加蒸馏水定容至1 000 mL,搅拌均匀.调pH 用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液,逐滴滴入溶化的培养基中,边滴边搅拌,并随时用精密的pH试纸（5.7.0）测培养基的pH,一直到培养基的pH为5.8为止（培养基的pH必须严格控制在5.8）.2 BA为细胞分裂素 NAA 是萘乙酸,为生长素的一种 3 适于百合根的激素暂时没找到 以下是叶片和胚的激素：对麝香百合 (LiliumlongiflorumThunb)叶片进行离体培养 ,可成功获得无菌苗.试验结果表明 :培养基MS +BA 0 1mg/L +NAA 1 0mg/L适于初代培养 ,有助于根和芽的分化 ;MS +BA 0 5mg/L +NAA1 5mg/L适于增殖培养 ,利于愈伤组织的产生 ,并促进芽的分化 ;生根培养基为 1/ 2MS +NAA 1 0mg/L +多效唑 10 0mg/L ;当试管苗根长 1cm时移栽易成活 在含有1 mg/ L IAA,1 m g/ L GA3,6 0 0 m g/ L CH的 MS培养基上培养 ,蔗糖含量为 6 8%时 ,百合幼胚胚性生长最好 ,培养 30 d后可以得到正常胚 .在含有 0 .1 m g/ L NAA,1 m g/ L BA的 MS培养基上可以形成淡绿色的愈伤组织 ,将这些愈伤组织转移到 1 / 2 MS无激素的培养基上培养可以形成大量的不定芽 ,不定芽生根移栽后 ,其成活率可达90 %以上